基因编辑技术与动物模型构建研讨会日程

日期

时间

主题

详细内容

第一天上午

9:00-10:30

基因修饰技术简介（一）

基因打靶与基因编辑技术（ZNF, TALENs，CRISPR/Cas9）介绍

基因编辑、基因修饰、基因打靶、转基因、基因敲除、基因敲入等专业领域概念梳理

CRISPR/Cas9结构和特点

如何使用CRISPR/Cas9系统对特定基因进行敲除或定点插入（详细方法步骤）

拓展如何提高定点敲入效率等知识

10:30-10:45

休息

10:45-12:00

基因修饰技术简介（二）

基因编辑工具Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14的结构、特点、工作原理

如何使用Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14系统进行编辑

Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14与Cas9的比较

Cas9、Cas12（Cpf1）、Cas13（C2C2）、Cas14的应用和技术展望

上午现场答疑

12:00-13:30

午饭及午休

第一天下午

13:30-14:00

CRISPR（sgRNA）设计方法和相关网站介绍

sgRNA设计方法和相关网站介绍

CRISPR（sgRNA）的在线设计（在线互动设计演练）

14:00-15:30

基因编辑实验详细操作

gRNA oligos模板退火

退火gRNA与线性化CRISPR/Cas9载体连接

连接产物转化到大肠杆菌（DH5α），转化产物涂板培养，CRISPR/Cas9重组子细菌克隆挑取，扩大化培养，鉴定阳性克隆

细胞转染（Electroperation，Nuclefection，Nanofection，X-fection）等介绍与应用拓展

单细胞克隆筛选（有限稀释法，滤纸法、环法、流式分选法等）方法介绍与应用拓展

15:30-15:45

15:45-17:00

利用CRISPR/Cas9技术编辑动物细胞系

CRISPR/Cas9质粒细胞转染方法

阳性细胞克隆筛选，基因修饰基因组DNA模板快速制备

目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物

PCR产物退火变性，T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况

17:00-17:30

CRISPR/Cas9关键点总结、归纳、拓展

基因编辑关键知识点归纳、总结和提炼

CRISPR/Cas9技术应用拓展（如CAB基因敲入方法等介绍）

第二天上午

9:00-10:30

利用基因编辑技术构建基因敲除或敲入小鼠

基因工程小鼠的详细分类与比较

小鼠受精卵分离和培养

CRISPR/Cas9系统显微注射到小鼠受精卵

受精卵显微注射后回输到代孕母鼠体内

PCR和T7E1分析和鉴定基因敲除小鼠（Founder）

基因敲除小鼠基因敲除情况分析

CRISPR/Cas9构建基因敲除小鼠详细实验流程归纳和总结

10:30-10:45

休息

10:45-11:15

利用基因编辑技术构建大动物模型

以大动物猪为例，进行详细介绍基因编辑技术在大动物模型中的应用

利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大型动物（猪）流程

基因修饰大型动物优势

利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪）模型介绍

11:15-12:00

利用基因编辑技术构建动物模型的详细案例介绍

利用CRISPR/Cas9构建基因修饰小鼠方法与相关基因修饰小鼠模型

利用CRISPR/Cas9构建基因修饰大动物（猪、猴）方法与相关基因修饰大动物模型

拓展基因编辑技术在其它物种中的应用

拓展基因编辑技术在其它物种中的应用

12:00-13:30

午饭及午休

第二天下午

13:30-15:00

实验结果的点评与讨论

CRISPR/Cas9载体构建讨论

目的靶基因的基因组DNA片段的PCR扩增，电泳检测PCR产物结果讨论

PCR产物T7E1酶切，电泳鉴定基因修饰情况结果讨论

Sanger测序鉴定基因编辑结果：CRISPR/Cas9质粒阳性转化子测序结果确认；Sanger测序阅读基因编辑情况；如何从测序色谱图中阅读靶向突变等位基因型

15:00-15:30

CRISPR/Cas9脱靶问题分析

脱靶产生的原因

脱靶检测方法

降低脱靶问题的方法

15:30-15:45

15:45-16:30

基因编辑领域进展大梳理与全面拓展

基因编辑技术的应用拓展介绍：SHERLOCK-V1、SHERLOCK-V2等应用于检测方面的拓展，Base editing

结合当下新型冠状病毒热点，基因编辑工具用于检测新型冠状病毒、基因编辑工具有可能应用于新冠治疗等应用的介绍与拓展

Cas系列突变体的介绍与应用

基因编辑的拓展应用（如应用于杜氏营养肌不良综合征、白内障、消灭蚊子、植物中的应用、细菌中的应用等）

基因编辑工具的伦理问题于讨论